Microbiologia

Microbiología:

La microbiología es la rama de la biología que estudia los microorganismos o microbios. Estos son tan abundantes y variados que se calcula que apenas se han estudiado un 1% de los microorganismos presentes en nuestro planeta. 

El laboratorio clínico se enfoca principalmente en el papel de los microorganismos como fuente de infecciones para los humanos. Esta es una de las secciones más tradicionales del laboratorio clínico y aquí en Costa Rica es de donde surge el nombre de nuestra profesión: microbiólogos. 

Los microbios estudiados por el laboratorio clínico se clasifican básicamente en 3 categorías:

• Los parásitos: nombre con que tradicionalmente se designa a las amebas y a los helmintos ("gusanos" o "lombrices")
• Las bacterias
• Los hongos

Este área del labortorio también ha ido evolucionado más allá del aislamiento y el cultivo manual.  Hoy podemos ofrecer a nuestros clientes una identificación bioquímica automatizada de los géneros y especies bacterianas que además incluye el antibiograma (prueba de sensibilidad de antibióticos) que permite seleccionar de manera precisa el tratamiento más efectivo para diversas infecciones que puedan aquejar a un paciente.

No obstante, como hemos dicho, la microbiología no está sólo concentrada en las bacterias. Para los hongos y las parásitos igualmente ofrecemos varios exámenes que permiten su diagnóstico. 

Los medios de cultivo en microbiología

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de estractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El Ágar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.

Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.

DISEÑO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos.

1.- Aporte de nutrientes

La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial además de los requerimientos nutricionales del microorganismo.

2.- pH

Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:

Utilización de carbohidratos ----> Producción de ácidos orgánicos ----> Acidificación

Catabolismo de proteínas ----> Producción de materiales nitrogenados ----> Alcalinización

Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampón. Uno de los más utilizados en microbiología es la combinación de KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH de aproximadamente 6,8.

3.- Necesidades de gases

Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:
i.- Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.
ii.- Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
iii.- Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre.
iv.- Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.

Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio.

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de O2.
B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2.
C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.

4.- Suministro de luz

Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación ya que la luz es su fuente de energía. Esta fuente de iluminación no debe plantear problemas de variación de temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor.

5.- Control de la temperatura

El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas, y la velocidad con que se efectúan estas reacciones está influída por la temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en los siguientes grupos:
i.- Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima es alrededor de los 15° C.
ii.- Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C.

iii.- Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.

6.- Otros requerimientos

Halófilas: bacterias que para su crecimiento requieren altas concentraciones de sal (10 - 15%). Son aquellas bacterias aisladas del mar y ciertos alimentos.

Otras bacterias, como las aisladas en las fosas marinas, requieren presiones superiores a las normales.

6.- Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

7.- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

8.- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

9.- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:

a) Su consistencia

b) Su utilización

c) Su composición

d) Su origen

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).

1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.

2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.

3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias

SEGÚN SU UTILIZACIÓN.

1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.

2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores  indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).

3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.

4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.

5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.

6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto último los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.

7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.

8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:

  a) haciendo pases periódicos de placa a placa,

  b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y

  c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.

9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc.

10) Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

11) Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN.

Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.

2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida.

3) Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Según su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser
extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma
de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios:

para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

Medios para identificación:

diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)

DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.

Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología.

Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial.

Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis(α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles.La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes. 

Agar sangre (=TSA = Trypticase Soja Agar)

El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de elección para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especies bacterianas.

Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sódico y 5% de sangre.

La aportación de caseina y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y péptidos de cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran varíedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen rápidamente, así como los del género Candida. Tambìén permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.

El cloruro sódico proporciona electrolitos esenciales. La adición de sangre de carnero desfibrinada enriquece la base y lo hace un medio adecuado para realizar la prueba del factor CAMP.

Permite así mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actúan sobre los glóbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemólisis beta, produce un halo transparentealrededor de la colonia hemolítica), parcial (hemólisis alfa, coloración verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteración (hemólisis gamma).

La producción de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como pH o atmósfera de incubación.

Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmósfera enriquecida en CO2.

Si se añade al medio el 0,5% de telurito potásico es muy útil par el cultivo y aislamiento selectivo de Corynebacterium diphteriae, Candida albicans, Listeria y estreptococos.

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formulación (según Becton Dickinson):

Digerido pancreático de caseina	15.0		g
Digerido papaico de haba de soja	5.0		g
Cloruro Sódico	5.0		g
Agar	15.0		g
Factores de crecimiento	1.5		g
Sangre desfibrinada de carnero	50.0		ml

Agar chocolate: 

El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos y meningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clásico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha añadido unamezcla de tres antibióticos específicos que impedirán el crecimiento del resto de la flora acompañante. Agar MacConkey: Es un medio utilizado para el aislamiento e identificación de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los gérmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composición lleva un azúcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los gérmenes que fermenten la lactosa producen una acidificación del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas serán incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja).

Chocolate Polyvitex (= Agar chocolate)

Este medio utiliza la misma base que el Ágar Sangre. Antiguamente se añadían los hematies a la base fundida y se elevaba la temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio sus componentes. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate.

El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio análogo a éste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, después de añadir antibióticos.

El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o Hemina termoestable.

Otros factores, en particular el factor V (dicotín-adenina nucleótido) termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate pueden aportarse en una mezcla químicamente definida: el PolyViteX.

El Agar chocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de los gérmenes encontrados en patología humana o veterinaria.

La siembra de líquidos cefalorraquídeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero está particularmente indicado para aislamiento de las Neisserias patógenas y de los Haemophilus.

Aislamiento e identificación de Haemophilus

Los microorganismos del género Haemophilus se cultivan en Agar chocolate con PolyVitex. Como en el caso del gonococo el cultivo es rápido y abundante sobre todo en atmósfera rica en C02. Estos gérmenes encuentran en este medio los factores X y V necesarios para su crecimiento. El diagnóstico de la serie al respecto puede conducirse de la manera siguiente:

Si se siembra en cuatro medios diferentes:

- Agar Trypcase-soja que no contenga ni factor V, ni factor X
- Agar Trypcase-soja con PolyViteX (factor V)
- Agar chocolate (factor X)
- Agar chocolate con PolyVitex (factores X y V)

El recuadro que se da a continuación indica los resultados obtenidos en estas condiciones con los principales Haemophilus:

H. parainfluenzae crece en Trypcase soja con PolyViteX (V) y en chocolate con PolyViteX (V yX)
H. aphrophilus crece Chocolate (X) y en chocolate con PolyViteX (V yX)
H. influenzae, H. haemolyticus, H. aegiptius crecen en los 4 medios

otras pruebas que ayudan a diferenciarlos:

H. aegiptius aglutina hematies humanos (prueba en porta), H. influenzae no los aglutina
H. haemolyticus da hemólisis en Agar con 5% de sangre de caballo

Agar Mac Conkey

El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la detección de organismos coliformes y patógenos entéricos.

Actualmente existen una gran cantidad de medios diseñados para el aislamiento, cultivo e identificaión de bacterias entéricas. El artículo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue publicado en 1905 y contenía una descripción detallada de su composición y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos. Su composición se ha modificado en numerosas ocasiones

Se partió de la idea de que las sales Biliares precipitan ácidos y que ciertos microorganismos entéricos fermentan la Lactosa mientras que otros no lo hacen.

La fórmula del agar MacConkey II es de 1983 y se diseñó especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el "swarming" de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa.

Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.

La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con la combinación de Lactosa con el indicador Rojo neutro.Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contario.

LECTURA:

colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas 
colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa)

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formulación (según Becton Dickinson):

Digerido pancreático de gelatina	17.0		g
Digerido pancreático de caseina	1.5		g
Digerido péptico de tejido animal	1.5		g
Cloruro Sódico	5.0		g
Agar	13.5		g
Lactosa	10.0		g
Sales biliares	1.5		g
Rojo neutro	0.03		g
Cristal violeta	0.001		g

Agar C.L.E.D.: 

El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus.La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.

Agar S.S.:

El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. Así, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y será exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioquímicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen.

Agar Salmonella-Shigella (SS)

Ágar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de Shigella.

Se diseñó para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibición de coliformes sin restringir el crecimiento de otros BGN patógenos.

Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa) producen colonias transparentes, translúcidas, mientras los pocos fermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas, rojizas.

Bacteria	Crecimiento	Color de las colonias
Salmonella enteritidis	bueno	incolora
Shigella flexneri	aceptable	incolora
Proteus mirabilis	regular	incolora
Enterococcus faecalis	escaso	incolora
Enterobacter aerogenes	regular	crema/rosa

Agar Hektoen :

Es un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azúcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obteniéndose colonias más numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibición tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que señalar que el vibrión colérico crece bien en este medio.

C.P.S. ID3. :Medio cromogénico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificación de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualización del cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrón). La identificación solo requiere la adición de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificación habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para detección de Streptococcus agalactiae, mediante la utilización de un sustrato cromogénico específico de este microorganismo.

Agar Mueller-Hinton:

 Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A él nos referiremos más ampliamente en el capítulo correspondiente

 -MULLER-HINTON : medio sólido estándar para antibiogramas con discos y por difusión

 -MULLER-HINTON/SANGRE : ATB bacterias que requieran sangre (Neumo. Strepto)

 -MULLER-HINTON/CHOCO : ATB microorganismos que requieran Factores (Haemophilus)

THAYER-MARTIN : 

selectivo Neisserias patóg. (N. lactamica, Gono/Meningo) para atmósfera de CO2

OXIDACION/FERMENTACION (GLUCOSA) : Estudio de utilización de Glucosa por los BGN

TREE SUGAR-IRON : tubo en pico flauta (base larga, pico corto), para estudiar Oxid/Ferm de Gluc-Lact-Sac, producción gas y SH2

Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio.

Agar Chapman: 

Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sódico permite la inhibición de la mayoría de los otros gérmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: así se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegérmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas).

Caldo de Tioglicolato

Es el caldo de enriquecimiento más utilizado en Microbiología.

Contiene 0,075 % de Ágar para evitar que las corrientes de convección transporten el oxígeno de la superficie a toda la masa del caldo. El ácido Tioglicólico actúa como agente reductor, disminuyendo aun más el potencial de óxido-reducción del medio.

Con el agregado de muchos factores nutrientes (Caseina, extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc), el medio permite el desarrollo de la mayor parte de las bacterias patógenas.

Hay distintas fórmulas modificadas en las que se han incluido otros componentes: un indicador de óxido-reducción (Resazurina), Glucosa, Vitamina K1 y Hemina.

Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto.

Medio de Loeffler: Es un medio específico para el cultivo de Corynebacterium difteriae.

Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez.

Agar Kligler: Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos conmás detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sódico.

Agar Schaedler

Schaedler + 5% sangre de cordero.

Este medio reductor está particularmente adaptado al cultivo de los gérmenes anaerobios.

La presencia de factores de crecimiento tales como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3, así como la adición de la sangre de cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes.

Debido al elevado contenido en glucosa de este medio, la intensidad de la hemólisis de los estreptococos puede disminuir.

Sembrar lo más rápidamente posible la muestra a su llegada al laboratorio. Las muestras deben ser transportadas en un medio que garantice la anaerobiosis (Portagerm tubo o frasco).

Después de sembrar, colocar inmediatamente las placas en la jarra de anaerobiosis o bien en sistema individual.

Agar Levine ó EMB (Eosina azul de metileno):Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas.

Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayoría de enterobacterias.El segundo pone además de manifiesto la pigmentación fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV.

K-W (Kanamicina-Vancomicina)

Se utiliza para el aislamiento rápido de Bacteroides sp.

Contiene 75 µg/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayoría de los bacilos aerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 µg/ml de Vancomicina, que inhibe a la mayoría de los microorganismos GramPositivos.

Contiene también sangre "lacada" de conejo que permite la pigmentación precoz de los Bacteroides sp pigmentados.

Muchas cepas de B. assaccharolyticus y B. gingivalis no crecerán en este medio debido a su sensibilidad a la Vancomicina.

Las levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicina pueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse una tinción Gram y confirmar la tolerencia al aire de todos los organismos aislados

fotografía: Dani Val

Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios.

Agar Gardnerella:Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias betahemolíticas características de Gardnerella vaginalis. Selectivo Gardnerella vaginalis. Contiene sangre humana para valorar hemólisis

Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42º C en microaerofilia.

BBE (=Bacteroides Bilis Esculina)

El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento e identificación presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis. Fue presentado en 1978 por Livingston y sus colaboradores.

La mayor parte de las infecciones humanas producidas por bacterias anaerobias son debidas a gérmenes pertenecientes al grupo Bacteroides fragilis (B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B. distasonis y B. vulgatus). Es importante una rápida detección e identificación de estos microorganismos ya que se ha observado un incremento de la resistencia a antibióticos mayor que en otros grupos de anaerobios.

El agar BBE permite una inhibición selectiva de microorganismos anaerobios facultativos y de la mayor parte de los anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall.

La diferenciación del grupo Bacteroides fragilis se basa en la hidrólisis de la esculina con producción de esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de hiero presente en el medio (citrato férrico amónico) produciendo una coloración marrón oscuro-negro rodeando a las colonias de de las cepas del grupo Bacteroides fragilis.

Contiene Amikacina que inhibe el desarrollo de los microorganismos aerobios, Bilis que inhibe a la mayoría de anaerobios excepto los del grupo B. fragilis y otras pocas especies, y Esculina que es útil para la detección de este grupo de microorganismos ya que por lo general son Esculina positivos.

También pueden crecer en este medio: Fusobacterium mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levaduras y algunos otros microorganismos.

Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):Se utiliza para el aislamiento de bacterias del género Legionella

SABOURAUD : Cultivo de hongos (incubar a Tª ambiente y a 37 gC)

SAB + Cloranfenicol y Actidione : Selectivo hongos patógenos

Agar de Czapek

Es un medio especializado para estudios de hongos.

Se utiliza de forma muy especial para estimular las características diferenciales de Aspergillus spp, lo que facilita su identificación, y para estimular la filamentación de Sporothrix schenckii.

XLD : Selectivo Salmonella y Shigella

SELENITO : Medio líquido de enriquecimiento selectivo para Salmonella-Shigella

CIN : Selectivo Yersinia

CLED : Medio de recuento urinario. Indicador de fermentación de Lactosa

CAMPY : Cultivo de Campylobacter

Löwenstein-Jensen:Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita parainhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.
Fundamento

Los nutrientes de este medio basal, más los aportados por el agregado de la mezcla de huevos, constituyen un rico soporte para el crecimiento de una gran variedad de micobacterias. El verde de malaquita inhibe a gran parte de la flora acompañante. Con el agregado de glicerina se estimula el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis, aunque gran parte de M. bovis es inhibido. Agregando un 5% de NaCl, se pueden seleccionar micobacterias tolerantes a la sal, como es el caso de M. smegmatis.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Fosfato monopotásico	2.5	Suspender 37,3 g del polvo en 600 ml de agua destilada y agregar 12 ml de glicerina. Calentar agitando continuamente y hervir un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C aproximadamente. Mezclar asépticamente un litro de huevo íntegro, evitando la formación de burbujas de aire y agregar al medio base. Mezclar el huevo y la base hasta uniformar. Distribuir en recipientes estériles adecuados y tapar herméticamente. Colocar los mismos en posición inclinada y coagular a 85-90°C durante 45 minutos.
Sulfato de magnesio	0.24
Citrato de magnesio	0.6
Asparragina	3.6
Harina de papa	30.0
Verde de malaquita	0.4
pH final:4.8 ± 0.1

Siembra

Se recomienda, en procedimientos de rutina, inocular la muestra previamente decontaminada, sobre la superficie del medio de cultivo.

Incubación

A 35-37°C. A los 7 días de incubación, se observa por primera vez si hubo crecimiento. Luego, observar cada semana, hasta un total de 8 semanas.

Resultados

Observar las características morfológicas y la presencia o ausencia de pigmento en las colonias. 

Microorganismos	Crecimiento	Características de las colonias
Mycobacterium tuberculosis	Excelente	Grandes, secas, amarillentas, granulares
Mycobacterium avium	Excelente	Lisas, sin pigmentos
Mycobacterium gordonae	Excelente	Lisas
Mycobacterium bovis	---	---

Características del medio

Medio preparado: verde pálido, opaco.

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-156-05	x 500g :Código:  B02-156-06	Por 3 tubos: B05-156-21

MEDIO OGAWA KUDOH

COMPOSICION:

•    FOSFATO MONOPOTASICO ANHIDRO

•    CITRATO DE MAGNESIO

•    GLUTAMATO DE SODIO

•    GLICEROL

•    AGUA DESTILADA

EMPLEO:

Medio para la realización de prueba de Tuberculosis.

CONTROL DE ESTERILIDAD:

Se le realiza un control de esterilidad llevando el 5% de la producción a incubadora por 24 horas entre 35 a 37°C.

CONTROL DE ACTIVIDAD:

El Instituto Nacional de Salud (INAS), realiza una prueba cada 6 meses.

ALMACENAMIENTO:

DE: 2°C a 8°C

MANEJO:

•    Limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar cuidadosamente la UV.

•    Trabajo en ambiente estéril, en cabina de flujo laminar y en el    área de influencia de un mechero.

•    Usar pipeteadores automáticos y pipetas automáticas estériles.

•    Mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible.

CUIDADOS:

Para el manejo del producto, con agentes contaminantes utilizar la indumentaria de protección adecuada.

FECHA DE EXPIRACION:

Su vida útil es de 6 meses.

PRESENTACION:

•    Tubo x 8.0 ml